熒光定量Q-PCR檢測(cè)知識(shí)“大攻略”！
熒光定量Q-PCR檢測(cè)的理論依據(jù)是什通過(guò)特定的待擴(kuò)增基因片段起始含量越大，則指數(shù)擴(kuò)增過(guò)程越短，當(dāng)擴(kuò)增速率趨于穩(wěn)定后，則無(wú)論原來(lái)樣品中起始模板含量多少，終擴(kuò)增片段的含量通常是一樣的。
理想的擴(kuò)增結(jié)果：Y=X×2n；
其中Y代表擴(kuò)增產(chǎn)物量，X代表PCR反應(yīng)體中的原始模板數(shù)n為擴(kuò)增次數(shù)；理論上PCR擴(kuò)增效率為100%，PCR產(chǎn)物隨著循環(huán)的進(jìn)行成指數(shù)增長(zhǎng)，但實(shí)際上：DNA的每一次復(fù)制都不*，即每一次擴(kuò)增中，模板不是呈2的倍增長(zhǎng)；實(shí)際應(yīng)為：Y=X(1+E)n，其中E代表擴(kuò)增效率：E=參與復(fù)制的模板/總模板，通常E≤1，E在整個(gè)PCR擴(kuò)增過(guò)程中不是固定不變的。通常X在1-105拷貝、循環(huán)次數(shù)n≤30時(shí)，E相對(duì)穩(wěn)定，原始模板以相對(duì)固定的指數(shù)形式增加，適合定量分析，這也就是所謂的指數(shù)期；隨著循環(huán)次數(shù)n的增加（>30次），E值逐漸減少，Y呈非固定的指數(shù)形式增加，后進(jìn)入平臺(tái)期。
熒光定量Q-PCR檢測(cè)的理論模式：
PCR是對(duì)原始待測(cè)模板核酸的一個(gè)擴(kuò)增過(guò)程，任何干擾PCR指數(shù)擴(kuò)增的因素都會(huì)影響擴(kuò)增產(chǎn)物的量，使得PCR擴(kuò)增終產(chǎn)物的數(shù)量與原始模板數(shù)量之間沒(méi)有一個(gè)固定的比例關(guān)系，通過(guò)檢測(cè)擴(kuò)增終產(chǎn)物很難對(duì)原始模板進(jìn)行準(zhǔn)確定量。
PCR擴(kuò)增通式：
1.Tn=T0（1+E）n；
2.Tn=Tn-1（1+E）n。
注：[0其中E表示擴(kuò)增效率，n為循環(huán)數(shù)，Tn表示在n個(gè)周期后PCR產(chǎn)物的數(shù)量，Tn-1表示在n-1個(gè)周期后PCR產(chǎn)物的數(shù)量，T0為原始模板數(shù)量。設(shè)定PCR到達(dá)指數(shù)擴(kuò)增期時(shí)，產(chǎn)生一定的熒光(熒光依賴(lài)于某一循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物的總量，即特定的拷貝數(shù)K，為常數(shù)，大約在1010左右)高于背景為儀器所識(shí)別，此時(shí)的循環(huán)數(shù)為CP,也就是K=T0（1+E）CP，取對(duì)數(shù)即：
lg K=lg T0+CP*lg(1+E)；
CP=-1/lg(1+E)*lg T0+lgk/lg(1+E)。
由于對(duì)一特定的PCR而言，E與K均為常數(shù)，故上式為循環(huán)數(shù)（CP）對(duì)原始模板拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)（lg T0）一次方程，其標(biāo)準(zhǔn)形式y(tǒng)=kx+b,該直線(xiàn)的斜率為-1/lg(1+E)，在橫坐標(biāo)上的截距為lgk/lg(1+E)，也是熒光定量PCR所謂的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。
根據(jù)PCR擴(kuò)增過(guò)程中是否加入某種標(biāo)記物、標(biāo)記物的種類(lèi)以及后檢測(cè)的信號(hào)的不同可分為四種類(lèi)型：
直接定量檢測(cè)法；同位素標(biāo)記定量；酶標(biāo)記定量檢測(cè)法；熒光定量Q-PCR技術(shù)。
熒光定量PCR主要原理發(fā)射波長(zhǎng)與受體熒光染料光染料吸收供體熒光傳遞的能量而激發(fā)出另一波長(zhǎng)的熒光，同時(shí)將供體熒光淬滅。
